同仁CCK8操作說明與檢測步驟(附初學者問答)
細胞活性檢測
1. 在96 孔板中接種細胞懸液 (100 ml /孔 ) 。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) (在37 ℃，5% CO2的條件下 )。
2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 O.D值的讀數(shù)) 。
3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4小時。
4. 用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。
5. 如果暫時不測定O.D值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。
細胞增殖 -毒性檢測
1. 在96 孔板中配制 100 ml的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24小時 ( 在37℃， 5% CO2的條件下 )。
2. 向培養(yǎng)板加入10 ml不同濃度的待測物質(zhì)。
3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間 (例如: 6,12, 24 或48小時 )。
4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 O.D值的讀數(shù)) 。
5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4小時。
6. 用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。
7. 如果暫時不測定O.D值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。
注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。當然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
制作標準曲線
1. 先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞。
2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做 3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復(fù)孔。
3. 接種后培養(yǎng)2-4 小時使細胞貼壁，然后加 CCK-8試劑培養(yǎng)一定時間后測定 O.D值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標 (X軸) ，O.D值為縱坐標 (Y軸) 的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量 (使用此標準曲線的前提條件是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入 CCK-8后的培養(yǎng)時間)。
同仁CCK8檢測步驟
1. 向各孔中加入100 μl細胞懸液。a)
2. 在37℃下預(yù)孵育培養(yǎng)板。b)
3. 向各孔中加入各濃度的待測溶液c)10 μl。
4. 37℃下孵育。
5. 向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液d)。
6. 37℃下孵育1-4小時。e)
7. 測定450 nm處的OD值。
a) 使用適當?shù)呐囵B(yǎng)基制備50,000-100,000個/ml的細胞懸液。
b) 建議使用CO2培養(yǎng)箱過夜預(yù)培養(yǎng)。
c) 使用培養(yǎng)基或PBS來制備溶液。
d) 如果待測溶液有還原性，測定不含細胞，但含有CCK-8的待測溶液在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相對較大，則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的100 μl培養(yǎng)基和10 μl CCK-8進行檢測。
e) 白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。
活力計算
細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度
A（0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力
DOJINDO CCK8 初學者問答 (同仁DOJINDO)
1.一個孔中應(yīng)接種多少個細胞？
當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。
2.能否用384孔板進行試驗？
可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養(yǎng)基體積20%的量。
3.能否用24孔板進行試驗？
可以。向各孔中加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液。
4.酚紅會影響檢測嗎？
不會。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
5.CCK-8與胸苷結(jié)合檢測之間是否有相關(guān)性？
有。然而，請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結(jié)果可能不同。
6.CCK-8能否檢測細菌細胞？
可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細胞。向100μl E.coli培養(yǎng)液中加入10 μl CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個小時或過夜。
7.CCK-8穩(wěn)定嗎？
CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20℃的儲藏條件。
8.如果沒有450nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？
還可使用450nm到490nm之間的濾光片。
9.如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？
可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。
10.CCK-8是什么顏色？
應(yīng)該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。
11.CCK8能否對活細胞進行染色？
不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8)，并通過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的，因此CCK8不能對細胞進行染色。
12.CCK8檢測溶液對細胞是否有毒？
CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個細胞培養(yǎng)液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測，如結(jié)晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養(yǎng)時，先檢測一下細胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。
13.在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？
有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK8發(fā)生顯色反應(yīng)，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。
14.每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？
可能會有以下幾個原因： 1. 當在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數(shù)量過多或過少。請預(yù)先在1,000100,000個/孔范圍內(nèi)摸索條件。
15.如何設(shè)定空白對照？
在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450nm的吸光度作為空白對照。
16.哪些物質(zhì)會影響CCK8的測定？
當有還原性物質(zhì)存在時會影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。
17.在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數(shù)量，如何解決？
可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時間由2小時縮短為1小時。
18.設(shè)定參比波長的目的是什么？必須設(shè)定嗎？
不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。
19.說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板貨12孔板，應(yīng)該加多少量CCK-8試劑？…
一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。
20.在CCK-8顯色過程中，如何終止反應(yīng)？
有一下幾種方法（96孔板）： 1、在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。 2、每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時之內(nèi)測定。
21.必須預(yù)培養(yǎng)細胞嗎？
不一定。如果要向保持細胞的最好狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細胞。如果不做細胞預(yù)培養(yǎng)，細胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有人不做細胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標準曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。
22.如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響？
金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話，將會100%抑制。
23.CCK-8試劑的保存條件？
在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。
24.預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細胞計數(shù)嗎？
一般情況下用胰蛋白酶處理對數(shù)增長期的細胞，用血球計數(shù)盤計數(shù)，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數(shù)細胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計數(shù)盤進行計數(shù)。
25.CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？
不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數(shù)量來解決。
26.懸浮細胞和貼壁細胞在數(shù)量上有何區(qū)別？
懸浮細胞由于染色比較困那，一般需要增加細胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數(shù)量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數(shù)。
27.應(yīng)該每次做標準曲線嗎？
建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。
28.有時在藥物作用情況下，細胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數(shù)量？…
不能。由于CCK-8是通過和細胞內(nèi)的脫氫酶進行反應(yīng)間接反映活細胞數(shù)量，如果細胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細胞數(shù)量將會比真實值高，不能真實反映活細胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。
29.實驗之前，是否需要先檢測一下培養(yǎng)基和CCK-8是否會反應(yīng)？
建議使用一個孔作一下檢測，因為有培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)，在正式實驗之前有必要先確認培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)。一般正常在的OD值應(yīng)該在0.4以下。
